Ekstraksi Protein Untuk Western Blotting

[ad_1]

Ekstraksi protein merupakan langkah penting untuk Western Blotting dalam penelitian kanker. Protein dari sampel (sel kanker) perlu diekstrak secara efisien tanpa degradasi. Meskipun protokol teknik ekstraksi protein ini cukup ilmiah dan teknis, saya masih ingin berbagi karena mungkin seseorang yang akan melakukan penelitian kanker akan menemukannya bermanfaat. Saya akan menjelaskan teknik ekstraksi protein nuklir dan sitoplasma.

Sebelum kita mulai melakukan ekstraksi protein, kita perlu menyiapkan reagen dan peralatan. Ada 3 reagen (CER I, CER II dan NER) yang kita butuhkan dalam ekstraksi protein nuklir dan sitoplasma. Sebelum reagen dapat digunakan, kita harus menambahkan protease dan phosphatase inhibitor koktail ke 3 reagen ini. Protease dan inhibitor phosphatase inhibitor memberikan solusi dengan perlindungan sampel penuh untuk melindungi protein dari degradasi selama ekstraksi. Dalam penelitian kanker saya, saya menambahkan rasio 1: 100 dari protease dan koktail inhibitor fosfatase ke reagen. Karena saya membutuhkan 200 ml CER I untuk setiap sampel yang akan diekstraksi, saya harus menambahkan 2 ml protease dan inhibitor phosphatase inhibitor untuk dicampur dengan reagen.

Sekarang kita dapat memulai protokol ekstraksi protein nuklir dan sitoplasma.

1. Pertama-tama, kita harus memutar 20 µl sel ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml pada 500 xg selama 3 menit. Setelah berputar, supernatan dibuang menggunakan pipet.

2. Kemudian, kita harus menambahkan 200 μl es dingin CER I ke pelet sel. Campuran tersebut dengan cepat vortex selama 15 detik sehingga pelet sepenuhnya diresuspensi. Tabung diinkubasi di atas es selama 10 menit.

3. Akibatnya, kita harus menambahkan 11 μl es dingin CER II dan vortex lagi selama 5 detik. Kemudian, tabung diinkubasi di atas es lagi selama 1 menit dan vortex selama 5 detik juga.

4. Selanjutnya, kita perlu memusatkan campuran. Sentrifugasi adalah proses untuk memisahkan isi dalam campuran. Setelah sentrifugasi pada 16.000 xg selama 5 menit, kita perlu mentransfer supernatan yang merupakan ekstrak sitoplasma ke tabung pra-dingin yang baru. Cukup simpan tabung di atas es sampai digunakan.

5. Kemudian, kita perlu mengekstrak protein nuklir. Pelet yang tidak larut diresuspensi dengan 100 μl es NER dingin dan vortex selama 15 detik.

6. Sampel diletakkan di atas es selama 10 menit dan vortex selama 15 detik. Langkah ini diulangi 4 kali dengan total 40 menit.
7. Kemudian, sampel disentrifugasi lagi pada 16.000 xg selama 10 menit. Supernatan yang merupakan ekstrak nuklir dipindahkan ke tabung yang sudah dingin dan disimpan di atas es sampai digunakan. Ekstraksi protein nuklir dan sitoplasma untuk Western Blotting dalam penelitian kanker dilakukan.

Setelah ekstraksi protein, kita perlu melanjutkan dengan kuantifikasi konsentrasi protein dengan menggunakan uji Bradford sebelum kita dapat melanjutkan ke SDS-PAGE.

[ad_2]